CRISPR TEKNOLOJİSİNDE YENİ KEŞİF; RETRONLAR

CRISPR teknolojisine katkı sunabilecek yeni çalışmalar yayımlanıyor. Mikropların henüz tam olarak bilinmeyen DNA’sı virüsleri yenmeye yardımcı olabiliyor ve genom düzenleme potansiyeline sahip olan bu mikroplar, CRISPR teknolojisi için de faydalı olabilir. Örneğin, retronlar, bazı bakterilerde bulunan DNA, RNA ve protein kompleksleridir ve şimdi araştırmacılar; gen düzenlemede faydalı olabilmesi için bunların üzerinde çalışıyor. 

Araştırmacılar 7 yıl önce bakteriler tarafından virüsleri engellemek için kullanılan bir savunma sistemini şimdi CRISPR teknolojisi olarak bilinen gen düzenleme aracına dönüştürdüklerinde, doğaya bakışımız yeni bir teknolojiye ilham verdi. Ancak ortaya çıkan başka bir gen düzenleme çalışması uygulamada gecikti. Son birkaç yıldır, araştırmacılar retronları (bazı bakterilerde bulunan DNA, RNA ve protein kompleksleri) tek hücreli organizmaların genomlarını değiştirmek için potansiyel olarak güçlü bir yola adapte ediyor.

Retronlar üzerinde çalışan iki araştırma ekibi, CRISPR gibi retronların bakteriyel bağışıklık sisteminin bir parçası olduğunu ve mikropları bakteriyofaj adı verilen virüslerden koruduğunu bildiriyor. Cell‘de yayımlanan bir çalışmada araştırmacılar, belirli bir retronun bakterileri nasıl savunduğunu ve virüsün çoğalıp başkalarına yayılmaması için yeni enfekte olmuş hücrelerin kendi kendini yok etmesini tetiklediğini anlattı. Strand Therapeuticste bakteriler üzerinde çalışan biyolog Anna Simon; Cell’de yayımlanan makalede retronlar için “Doğal bir işlevi somut olarak belirleyen ilk şey” diyor. Şimdiye kadar sadece ön baskı olarak çıkan bir başka makale de benzer bir bulgu bildiriyor. Retronların doğal işlevine ilişkin yeni çalışmalar, onları çalıştırmaya yönelik araştırmaları artırabilir.

Weizmann Bilim Enstitüsünden mikrobiyal genomikçi ve Cell’deki araştırmanın baş yazarı Rotem Sorek, retronların, “doğru ve verimli genom düzenleme için oldukça etkili araçlar” olduğunu söylüyor. Ancak retronlar henüz CRISPR ile rekabet edemiyor, çünkü teknoloji memeli hücrelerinde çalışmak için henüz uygun değil.

Retronların hikayesi; CRISPR teknolojisine katkı sunmaya giden yol

1980’li yıllarda bir toprak bakterisini inceleyen araştırmacılar, hücrelerdeki tek iplikli DNA’nın kısa dizilerinin birçok kopyasını buldu. Her bir DNA parçasının tamamlayıcı bir baz dizisine sahip bir RNA’ya eklendiğini öğrendiklerinde bilinmezlik derinleşti. Sonunda ters transkriptaz adı verilen bir enzimin, bu DNA’yı bitişik RNA’dan yaptığını ve üç molekülün (RNA, DNA ve enzim) bir kompleks oluşturduğunu fark ettiler.

Ters transkriptaz için retron olarak adlandırılan benzer yapılar, birçok bakteride bulundu. Texas Üniversitesinden biyofizikçi Ilya Finkelstein, “Gerçekten olağanüstü biyolojik varlıklar ancak kimse ne işe yaradıklarını bilmiyor” şeklinde konuşarak retronları anlattı.

Sorek ve meslektaşları, fajlarla savaşmada kullanılan genler için 38 bin bakteri genomunu araştırırken; bunların işlevlerine yönelik ilk ipuçlarına ulaştı. Bu tür genler birbirine yakın olma eğilimindedir. Ekip, CRISPR ve diğer bilinen antiviral yapıların genlerinin yanında yeni savunma sistemleri arayan bir bilgisayar programı geliştirdi. Retronlarla ilgili bir makaleye rastlayan Weizmann Bilim Enstitüsünden lisansüstü öğrencisi Adi Millman, dizilerin RNA bileşenlerinden birini kodladığını fark etti.

Ekip, daha sonra retron bileşenlerini kodlayan DNA’nın genellikle bir protein kodlayıcı gene eşlik ettiğini ve proteinin retrondan retrona değiştiğini fark etti. Araştırmacılar, dizi kümesinin yeni bir faj savunmasını temsil ettiği yönündeki görüşlerini test etmeye karar verdi. Bakterilerin çeşitli virüsleri yenmek için üç bileşene (ters transkriptaz, DNA-RNA hibrit ve ikinci protein) ihtiyaç duyduğunu göstermeye çalıştılar.

Sorek ve meslektaşları, Ec48 adlı bir retron için ilişkili proteinin bir bakterinin dış zarına girerek ve geçirgenliğini değiştirerek büyük darbe sağladığını gösterdi. Araştırmacılar, retronun bakterinin ilk antiviral savunma hattı olan başka bir moleküler kompleksi bir şekilde “koruduğu” sonucuna vardı. Bazı fajların kompleksi etkisiz hale getirerek retronun zarı yok eden proteini serbest bırakmasını ve enfekte olmuş hücreyi öldürmesini tetiklediği buldular.

İkinci bir grup da benzer sonuçlara ulaştı. Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarından (EMBL) mikrobiyolog Athanasios Typas liderliğindeki grup, bir Salmonella bakterisindeki retron için kodlama yapan genlerin yanında Salmonella’ya toksik protein sağlayan bir gen olduğunu fark etti. Ekip, retronun normalde toksini sardığını ancak bakteriyofaj proteinlerinin varlığında onu etkinleştirdiğini keşfetti.

İki grup, 2019 yazında bir EMBL toplantısında bir araya geldi. Ekipler eşzamanlı olarak Haziran ayında bioRxiv‘de çalışmalarının ön baskılarını yayımladı.

Retronlarla tasarlanan CRISPEY teknolojisi nedir?

Bu keşiflerden önce bile, diğer araştırmacılar retronların o zamanki bilinmeyen özelliklerinden yeni gen teknolojileri tasarlamak için yararlanmıştı. CRISPR, genomun istenen bölgelerini kolayca hedefleyen ve bunlara bağlanan veya bunları kesen bir teknolojiir ancak şimdiye kadar hedef DNA’ya yeni kod eklemede çok başarılı olamıyor. Retronlar, CRISPR unsurları ile birleştirildiğinde ters transkriptazları sayesinde daha iyisini yapabilir; konak genomuna verimli bir şekilde eklenebilir, istenilen dizinin birçok kopyasını üretebilir. Simon, “CRISPR tabanlı sistemler ve retronların farklı güçlü yönleri olduğundan, bunları birleştirmek son derece umut verici bir strateji” diyor.

2018’de Stanford Üniversitesi laboratuvarındaki araştırmacılar, CRISPEY (homoloji yoluyla Cas9 retron paralel düzenleme) olarak adlandırılan retrondan oluşturulan temel bir düzenleme teknolojisini tanıttı. İlk olarak, RNA’sı maya genleriyle eşleşen ancak bir temel mutasyona uğramış retronlar yaptılar. Bunları, CRISPR’ın hedeflenen DNA’yı barındıran “kılavuz RNA” ve CRISPR’ın moleküler makası görevini gören CAS9 enzimi ile birleştirdiler. CAS9 DNA’yı kestikten sonra, hücrenin DNA onarım mekanizmaları maya genini retronun ters transkriptazı tarafından üretilen DNA ile değiştirdi.

CRISPEY, Stanford lisansüstü öğrencisi Shi-An Anderson Chen ve meslektaşlarının her biri temel değişikliklere uğramış on binlerce maya mutantını etkili bir şekilde yapmasını sağladı. Bu, örneğin mayanın glikozda gelişmesi için hangi bazların gerekli olduğunu belirlemelerine yaradı.

Kaynaklar: Science/ Bilimma- Hilal Bardakcı