BİYOTEKNOLOJİK İLAÇLARDA PROSES GELİŞTİRME VE ÜRETİM

DR. DUYGU AYYILDIZ TAMİŞ

SEÇİL DAYANKAÇ ÜNVER, MSC

EMRE BURAK ERKAL, MSC

DR. AHMET EMİN ATİK

DR. DENİZ BAYÇIN

PROF. DR. R. SERDAR ALPAN

BİYOTEKNOLOJİK İLAÇLARDA PROSES GELİŞTİRME VE ÜRETİM

Ülkemizde kullanılan biyoteknolojik ilaçların tamamına yakını ithal edilmektedir. Bu nedenle ülkemizde biyoteknolojik ilaçların üretimine geçilmesi zorunlu görünmektedir. Biyoteknoloji, özellikle uzun yıllara dayanan bir üretim kültürümüzün bulunduğu konvansiyonel ilaç alanına göre, birikimimizin daha az ve yetkinliklerimizin hızla geliştirilmesinin gerekli olduğu bir alandır. Biyobenzer ilaç geliştirme süreci yoğun AR-GE çalışması gerektirmektedir. Biyobenzer ilaç üretimleri, orijinal molekülün hücre hattından tamamen farklı bir hücre hattından yapılmaktadır. Bu yeni hücre hattına bağlı olarak üst akım ve alt akım proseslerinin de yeniden tasarlanması ve optimize edilmesi gerekmektedir.

Turgut Grubu, 50 yılı aşkın deneyimi ve güçlü finansal yapısı ile sanayimizin önemli girişimci kuruluşlarından biridir. Turgut İlaçları’nın temel amacı, Türkiye’de uluslararası standartlarda Ar-Ge’ye dayalı bir biyoteknoloji altyapısı oluşturmak, Türkiye ve dünya pazarına yönelik yüksek kaliteli biyoteknoloji ürünleri geliştirmek, üretmek ve pazarlamaktır. Son beş yıldır ilaç ile ilgili faaliyetlerini Turgut İlaçları bünyesinde toplayan grup, ülkemizin ve dünya pazarlarının biyoteknoloji ilaçları alanında giderek büyüyen ihtiyacını karşılamak ve bu ilaçlara daha düşük fiyatlarla erişim sağlanması amacıyla biyobenzer biyoteknoloji ilaçları üretecek bir üretim tesisi kurulması için yatırım kararı almıştır. Firmamız bu yatırım kararı çerçevesinde, 2013 yılından bu yana gerçekleştirdiği AR-GE laboratuvarı yatırımı ile kendi ürünlerinin ruhsatlarını almayı hedef edinmiştir. Acıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi Kampüsü’nde kurulan ve faaliyete geçen Turgut İlaçları Biyoteknoloji Merkezi, monoklonal antikor yapısında yüksek kaliteli biyobenzer ürünlerin hücre kültüründen başlayarak üretim aşamasına kadar geliştirilmesi için gerekli tüm teknik donanıma ve yetişmiş uzman ekibe sahip Türkiye’nin ilk merkezidir. Turgut İlaçları Biyoteknoloji Geliştirme Merkezi, Mart 2017 tarihinde Bilim ve Sanayi Bakanlığı tarafından AR-GE Merkezi onayı almıştır.

Turgut İlaçları A.Ş. geçtiğimiz 5 sene boyunca alanında uzman uluslararası kuruluşlarla iş birliği içerisinde biyobenzer monoklonal antikorların geliştirilmesi ve üretilmesi üzerine çalışmalar yapmaktadır. Monoklonal antikor geliştirme, üretim ve karakterizasyonu konularında çok uluslu Merck, Selexis, Covance, KBI Biopharma, Eurofins ve Paraxel ile Turgut İlaçları A.Ş. arasında iş ortaklığı yapılmış, sürdürülebilir bir geliştirme ve üretim platformunun Türkiye’de kurulabilmesi için başarılı girişimlerde bulunulmuştur.

Dünya Sağlık Örgütü'nün (WHO) tanımına göre; biyobenzer ilaç, ruhsatlı referans (orjinatör) biyoterapötik ürüne kalite, güvenlilik ve etkinlik açısından benzer olan üründür. Dünyada biyobenzer üretiminin AR-GE’sinde sahip olunması gereken yetkinlikler, aşağıdaki gibi yedi ana başlıkta özetlenebilir. Bunlar:

1. Hücre hattı geliştirme

2. Besi yeri ve besleme stratejilerinin geliştirilmesi

3. Küçük ölçek biyoreaktörlerde üretim stratejisinin geliştirilmesi

4. Saflaştırma tekniklerinin geliştirilmesi

5. Karakterizasyon analiz metotlarının geliştirilmesi

6. Pilot ölçekte biyoreaktör ve saflaştırma stratejilerinin geliştirilmesi

7. Faz I çalışmaları

 Endüstriyel Hücre Hattı Geliştirme Çalışmaları

Bu çalışmanın temel aşamaları şu şekildedir:

1. Orjinatör ürün gen dizilimlerinin belirlenmesi
2. Kodon optimizasyonu
3. Sentetik olarak gen dizilimlerinin sentezlenmesi
4. Sentezlenen gen diziliminin ekspresyon vektörüne klonlanması
5. Ekspresyon vektörünün konak hücreye transfeksiyonu
6. Limit dilüsyon yöntemiyle monoklonal hücre oluşturulması
7. Süpertransfeksiyon tekniği uygulamaları
8. EMA ve FDA standartlarına uygun bir şekilde biyobenzer üretimini sağlamak için limit dilüsyon yönteminin tekrarlanması
9. Yüksek canlılık gösteren klonların seçilerek kesikli kültüre aktarılması
10. Kesikli kültürde yüksek verimlilik gösteren klonların kesikli-beslemeli kültüre aktarılması
11. Titre, hücre canlılık ve glikan analizleri ile en iyi 4-6 klona karar verilmesi

Üst Akım Proses Geliştirme Çalışmaları

Bugünkü endüstriyel biyoteknoloji bilgileri ve deneyimi, istenen tüm özellikleri taşıyan bir biyoteknoloji ürününün üretilmesi için gerekli proses parametrelerinin küçük ölçekte sistematik bir çalışma ile belirlenmesine ve bu parametrelerin yüksek bir doğrulukla büyük ölçekli üretimlere aktarılmasına imkân vermektedir. Bu çerçevede küçük ölçekte belirlenen proses parametreleri büyük ölçekli üretimler için temel önemdedir. Bir başka anlatımla, küçük ölçekte istenen kritik kalite özelliklerine sahip bir ürünün üretilmesini sağlayan proses koşulları, uygun ölçek büyütme modeli kullanılarak büyük ölçekli üretimlerin proses parametrelerinin belirlenmesine olanak sağlamaktadır. Bu durum, aynı kalite özelliklerine sahip ürünlerin, büyük ölçeklerde de rahatlıkla üretilmesini mümkün kılmaktadır. Bu nedenle küçük ölçekte belirlenen proses parametreleri ile üretilen ürün, prototip olarak kabul edilmektedir. Hücre kültürü prosesleri, klona özgü proseslerdir ve iş yoğun bir optimizasyon sürecine ihtiyaç duyarlar. Dolayısıyla, yeni bir hücre soyundan, hücrenin ve molekülün özellikleri göz önünde bulundurularak üst akım prosesinin optimizasyon çalışmaları yapılmaktadır.

Seçilen öncü klon ile proses optimizasyon çalışmaları yapılarak referans ürün kritik kalite özelliklerine ileri derecede benzeyen biyobenzer ürünün prototipi geliştirilir. Bu süreçte, Spintube, Erlenmayer, mikro-biyoreaktör ve 3-5 L’e kadar laboratuvar ölçekli biyoreaktör sistemlerinden yararlanılmaktadır. Sürecin ana adımları aşağıda belirtilmiştir:

1. Besi yeri ve besleme stratejilerinin belirlenmesi
2. Öncü klonlarda gerçekleşen klon stabilite çalışması
3. Farklı proses parametrelerinin denendiği uygun besiyeri ve besleme stratejisindeki erlen çalışmaları
4. Reaktörlerde kritik proses parametrelerini (pH, sıcaklık, karıştırma hızı, O₂ miktarı ve gaz oranlarını) belirlemek üzere yapılan optimizasyon çalışmaları
5. Reaktörlerde konfirmasyon çalışmaları
6. Ölçek büyütme stratejilerinin uygulanarak 50 L ve 200 L’de non-GMP üretim yapılması
7. Faz I için 200 L GMP üretim yapılması

Alt Akım Proses Geliştirme Çalışmaları

Üst akım proses geliştirme kısmında özetlendiği gibi alt akım prosesinde de küçük ölçekte belirlenen proses parametreleri büyük ölçekli üretimler için temel önemdedir. Bir diğer deyişle, kritik kalite özelliklerine sahip bir ürünün saflaştırılmasını sağlayan küçük ölçekli proses koşulları, uygun ölçek büyütme stratejisi kullanılarak, aynı kaliteyi sağlayan büyük ölçekli saflaştırma proses parametrelerinin belirlenmesine olanak vermektedir. Bu nedenle, küçük ölçekte belirlenen alt akım proses parametreleri ile elde edilen ürün hammaddesi, prototip olarak kabul edilmektedir. Kritik proses parametrelerini sağlayan alt akım proses geliştirme çalışmaları kapsamındaki kromatografi basamaklarının belirlenmesi ve optimizasyonu bu nedenle büyük önem arz etmektedir.

Alt akım proses geliştirme çalışmalarında, saflaştırma verimleri ve ürünün belirlenen kritik kalite parametreleri (agregat, fragment, konak hücre proteini, kalıntı DNA ve protein A miktarları vb.) göz önünde bulundurularak kromatografi kolonlarının dinamik bağlanma kapasiteleri ve seçilen kromatografi basamaklarının optimizasyonları yapılmaktadır. Seçilen her bir kromatografi basamağında o kromatografi tekniğine özgü olan farklı rezin denemelerinin yapılması ve farklı proses koşullarının denenerek optimum çalışma koşullarının bulunması gerekmektedir. Afinite kromatografisi, katyon değişim kromatografisi (CEX), anyon değişim kromatografisi (AEX), hidrofobik etkileşim kromatografisi (HIC) ve karışık mod kromatografi (MMC) teknikleri biyoteknoloji ürünlerinin saflaştırma proseslerinde en çok kullanılan tekniklerdir (Kelly 2017; Shukla et al., 2007). Alt akım prosesinde kullanılan basamaklar aşağıda özetlenmiştir. Bunlar:

1. Klarifikasyon basamağının optimizasyonu
2. Afinite kromatografisi basamağının optimizasyonu
3. Viral inaktivasyon çalışmaları ve optimum viral aktivasyon zamanının bulunması
4. II. Kromatografi basamağı çalışmaları (CEX, MMC ve HIC denemeleri)
5. III. Kromatografi basamağı çalışmaları (CEX, MMC ve HIC denemeleri)
6. Konsantrasyon ve diafiltrasyon (TFF) optimizasyonu’dur.

Fizikokimyasal ve Fonksiyonal Analiz Geliştirme Çalışmaları

Üst akım ve alt akım proses geliştirmede yüksek titrede üretilen biyobenzer ilaçların fizikokimyasal ve fonksiyonel analizlerinin referans ürün (orjinatör) ile karşılaştırmalı olarak yapılması gerekmektedir. Yapılan analizlerin sonucunda elde edilen veriler, üretilen biyobenzer ilacın referans ilaca ait kritik kalite parametrelerinin kabul edilebilir farklılık aralıklarının içinde olduğunu göstermektedir. Kullanılan AR-GE sistematiği ile biyobenzer ilacın referans ilaç ile aynı kalitede olması sağlanmalıdır.

Farmasötik proteinlerin karakterizasyonu, ürün geliştirilmesi ve kabulü için önemlidir. Bunun yanında, ürünün yapısının, fonksiyonunun, saflık profilinin ve degredasyon yolağı ilişkilerinin anlaşılabilmesi için de gereklidir. Bunun için belirlenmesi gereken bir seri nitelikler mevcuttur (Wang and Hosken, 2014):

Yapısal karakterizasyon ve konformasyon:

• Amino asit sekans analizi,
• Amino asit kompozisyonu,
• Terminal amino asit kompozisyonu
• Peptit haritası,
• Sülfidril grup(ları) ve disülfit bağları,
• Karbonhidrat yapısı,
• Fosforilasyon,
• Deaminasyon,
• Oksidasyon.

 Fizikokimyasal özellikler:

• Moleküler ağırlık ve boyut,
• İzoform deseninin oluşturulması,
• Ekstinksiyon katsayısı,
• Elektroforetik deseninin oluşturulması,
• Sıvı kromografik deseninin oluşturulması,
• Spektroskopik profil,
• Saflık, safsızlık ve kontaminantların varlığı,
• Miktar.

Her biyobenzer ürün, orjinatör (referans) üründen farklı bir hücre hattı ve üretim süreci ile üretildiğinden, biyobenzerlerin referans ürünleri ile aynı olması beklenmemektedir. Bunun yerine, biyobenzerlerin ürün özelliklerinde klinik güvenlik ve etkinliği etkilemeyen küçük farklılıklar olacaktır. FDA ve EMA, klinik kullanımda ürünün güvenliği ve etkinliği konusunda kayda değer riskler olmaksızın yapı ve fonksiyon benzerliğini göstermek için analitik, biyolojik, klinik olmayan ve klinik verilerden oluşan sağlam bir veri paketi oluşturulması için kılavuzlar yayınlamıştır (EMA 2018, FDA 2015, FDA, 2018).

Turgut İlaç Biyoteknoloji Merkezi’nde geliştirilen ve karşılaştırmalı analizlerde kullanılan her bir fizikokimyasal ve fonksiyonel analiz metodu aşağıda özetlenmiştir. Bunlar:

1. İntak kütle analizi
2. İndirgenmiş intak kütle analizi
3. Glikan analizi
4. Fragmanlarına ayrılmış kütle analizi
5. Peptit haritalama
6. S-S bağı analizleri
7. GluC peptit analizi
8. CE-SDS indirgenmiş IgG analizi
9. CE-SDS indirgenmemiş IgG analizi
10. Asidik ve bazik varyant analizi
11. Karboksipeptidaz ile kesilmiş IgG analizi
12. Bağlanma analizi
13. Sitotoksisite analizi
14. SDS-Page analizi
15. Western-blot analizi
16. FTIR analizi
17. SEC analizi
18. SEC-MALS analizi
19. CD analizi
20. DSC analizi
21. Konak hücre protein analizi
22. Kalıntı PA analizi
23. Kalıntı DNA analizi

Hem referans hem de üretilen Turgut biyobenzer molekülünün benzer olduğunu gösteren sıvı kromatografisi kromatogramları ve yine her iki ilaçtaki amino asit diziliminin aynı olduğunu gösteren sıvı kromatografisi-UV kromatogramları karşılaştırmalı olarak Şekil 2’de verilmiştir.

Ölçek Büyütme Çalışmaları

Ölçek büyütme çalımalarında, hem biyoreaktör koşulları hem de alt akım saflaştırma koşulları, küçük ölçekte verim ve ürünün kritik kalite özellikleri açısından optimize edilmesinden sonra, projenin bu basamağında laboratuvar ölçeğinde biyoreaktör koşullarının ve optimize edilen saflaştırma basamaklarının pilot ölçekli yüksek kaliteli ürün üretimine aktarılması hedeflenmektedir. Bu amaçla, ürünün kritik kalite parametrelerini sağlayacak uygun pilot ölçek stratejileri kullanılarak 200-L pilot ölçekli biyoreaktör üretimi ve ardından saflaştırma işlemleri gerçekleştirilir.

Yeterli miktarda monoklonal antikor üretimi için iki farklı strateji takip edilebilir. Birincisi, proses verimliliğini arttırarak prosesi güçlendirmek, ikincisi ise üretim ölçeğini arttırmaktır. Biyoreaktörlerin daha büyük hacimlerde kullanılması veya aynı hacimde birçok biyoreaktör kullanılarak üretim ölçeğinin arttırılması mümkündür. Ekipman sayısı ile maliyet arasında pozitif bir korelasyon vardır. Bu nedenle, endüstriyel kullanım için büyük hacimlerde reaktörler kullanmak daha elverişlidir. Pilot ölçekli proseslerde amaç; hücrelerin kinetik karakteristiklerini, oksijen, pH, sıcaklık gereksinimlerini, kayma gerilimine karşı duyarlılıklarını ve üretim modellerini göz önüne alarak, verim/ verimlilik ve ürün kalitesini etkilemeyecek şekilde, laboratuvar ölçekte optimize edilmiş koşulları pilot ölçeğe aktarmaktır. Karıştırmalı tank biyoreaktörlerde proses geliştirme işlemi doğrudan hacimsel artışa bağlıdır ve farklı ölçeklerde dikkate alınması gereken en önemli kriter, karıştırıcı hızının değerlendirilmesidir (Chisti, 1993; Yang et al., 2007; Griffiths and Flickinger, 2010; Augusto et al., 2008; Zhang, 2010; Xing et al., 2009; Gossain and Mirro, 2010). Hücre kültürü biyoreaktörlerinde pilot ölçekli çalışmalarda sıklıkla kullanılan kriterler:

1. Birim hacim başına aktarılan gücün sabit tutulması, Pg/V

2. Karıştırıcı ucu hızının sabit tutulması

3. Karışma süresinin sabit tutulması

4. Hacimsel oksijen transfer katsayısının sabit tutulması, k_La

Pilot ölçekli alt akım proses geliştirme çalışmalarında, kromatografik ve kromatografik olmayan ekipmanın ve tamponların hazırlanmasıyla ilgili konuların ayrıntılı olarak dikkate alınması gerekir. Pilot ölçekli kromatografi işlemleri, ölçeğe bağlı ve bağımsız parametrelere dayanmaktadır. Lineer akış hızı (cm/saat), kolon yatağı yüksekliği, ürün konsantrasyonu, ürün miktarının kromatografi reçinesi hacmine oranı gibi ölçekten bağımsız parametreler sabit kalırken; sütun çapı, hacimsel akış hızı (ml/dak), kolona yüklenen toplam ürün, numune hacmi ve tampon hacmi, proses ölçeğinde yükselir (Milne 2017). Kromatografi aşamaları biyoteknoloji ürünlerinin saflaştırma süreçlerinde önemli bir rol oynamasına rağmen, filtrasyon adımları da oldukça önemlidir. Buna göre, pilot ölçekli filtre boyutlandırma işlemi çok önemlidir. Pilot ölçekli alt akım prosesinde dikkate alınması gereken bir diğer kritik nokta, proses boyunca gerekli olacak tamponların miktarıdır (Aldington and Bonnerjea, 2007).

Bu aşamada, laboratuvar ölçeğinde optimize edilen proses parametreleri göz önünde bulundurularak, pilot ölçek proses geliştirme çalışmaları sonucunda, en uygun pilot ve büyük ölçekli üretim stratejisi belirlenir.

Özetle, Turgut İlaçları A.Ş. bünyesinde burada tanımlanan AR-GE sistematiği kullanılarak referans ürüne ileri derecede benzer biyobenzer molekül prototipleri geliştirilmiş ve EMA ve FDA kriterlerine tam uyumlu ileri teknolojik yöntemler kullanılarak bu benzerlik gösterilmiştir.

 Kaynaklar:

Butler M. Optimisation of the cellular metabolism of glycosylation for recombinant proteins produced by mammalian cell systems. Cytotechnology. 2006; 50(1–3):57–76.

Agarabi, C.D., Schiel, J.E., Lute, S.C., Chavez, B.K., Boyne, M.T., Brorson, K.A. and Read, E.K., 2015, Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett–Burman Design for a Model Monoclonal Antibody, Journal of pharmaceutical sciences, 104(6): 1919-1928 p.

Aldington S. and Bonnerjea J. Scale-up of monoclonal antibody purification processes. Journal of Chromatography B, 848 (2007) 64–78.

Augusto, E.F., Barral, M.F. and Piccoli, R.A., 2008, Mathematical models for growth and product synthesis in animal cell culture (Ch. 8), Castilho, L.R., Moraes, A.M., Augusto, E.F.P. and Butler, M. (Eds.), Animal Cell Technology: From Biopharmaceuticals to Gene Therapy, Taylor and Francis Group, New York, 181 p.

Chisti, Y., 1993, Animal cell culture in stirred bioreactors: Observations on scale-up, Bioprocess Engineering, 9(5): 191-196 p.

del Val, I.J., Kontoravdi, C. and Nagy, J.M., 2010, Towards the implementation of quality by design to the production of therapeutic monoclonal antibodies with desired glycosylation patterns, Biotechnology Progress, 26(6): 1505-1527 p.

EMA. European Medicines Agency. Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: quality issues (revision 1). 2018.

FDA. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics Evaluation and Research. Quality considerations in demonstrating biosimilarity of a therapeutic protein product to a reference product. Guidance for industry. 2015.

FDA. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Statistical approaches to evaluate analytical similarity. Guidance for Industry. 2018.

Gossain, V. and Mirro, R., 2010, Linear scale-up of cell cultures, BioProcess International. December, 58-62 p.

Griffiths, J.B. and Flickinger M.C., 2010, Mammalian Cell Culture Reactors, Scale‐Up, Flickinger M.C. (Ed.), Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology Bioprocess, Wiley, 2282-2292 p.

Gronemeyer, P., Ditz, R., & Strube, J. (2014). Trends in Upstream and Downstream Process Development for Antibody Manufacturing. Bioengineering, 1(4), 188–212. https://doi.org/10.3390/bioengineering1040188

Hacker, D.L., De Jesus, M. and Wurm, F.M., 2009, 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells—where do we go from here?, Biotechnology Advances, 27(6): 1023-1027 p.

Horenstein A.L. , Crivellin F., Funaro A., Said M. and Malavasi F. Design and scaleup of downstream processing of monoclonal antibodies for cancer therapy: from research to clinical proof of principle. Journal of Immunological Methods 275 (2003) 99– 112.

Hughmark GA. 1980. Power requirements and interfacial area in gas–liquid turbine agitated systems. Ind Eng Chem Proc Des Dev 19:638– 641.

Johnston, R., Lambert, J. and Stump, E., 2012, An industry perspective on quality by design, BioProcess International, 10(3): 26-35 p.

Kelley B. Downstream Processing of Monoclonal Antibodies: Current Practices and Future Opportunities. Process Scale Purification of Antibodies. 2017; 1-21.

Lawrence, X.Y., 2008, Pharmaceutical quality by design: product and process development, understanding, and control, Pharmaceutical Research, 25(4): 781-791.

Li, F., Vijayasankaran, N., Shen, A., Kiss, R. and Amanullah, A., 2010, Cell culture processes for monoclonal antibody production, MAbs, 2(5): 466-479 p.

Marichal-Gallardo, P. A., & Álvarez, M. M. (2012). State-of-the-art in downstream processing of monoclonal antibodies: Process trends in design and validation. Biotechnology Progress, 28(4), 899–916. https://doi.org/10.1002/btpr.1567

Milne J. J., Scale-Up of Protein Purification: Downstream Processing Issues. Dermot Walls and Sinéad T. Loughran (eds.), Protein Chromatography: Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology, vol. 1485, pp: 75-76. © Springer Science+Business Media New York 2017

Rathore, A.S., 2009, Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products, Trends in Biotechnology, 27(9): 546-553 p.

Seamans, T.C, Fries, S., Beck, A., Wurch, T., Chenu, S., Chan, C., Ushio, M., Bailey, J., Kejariwal, A., Ranucci, C., Villani, N., Ozuna, S., Goetsch, L., Corvaia, N., Salmon, P., Robinson, D.K. and Chartrain, M., 2008, Cell cultivation process transfer and scale-up in support of production of early clinical supplies of an anti IGF-1R antibody, Part 1, BioProcess International, 6(3): 26-36 p.

Shukla, A. A., & Thömmes, J. (2010). Recent advances in large-scale production of monoclonal antibodies and related proteins. Trends in Biotechnology, 28(5), 253–261. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2010.02.001

Shukla, A. A., Hubbard, B., Tressel, T., Guhan, S., & Low, D. (2007). Downstream processing of monoclonal antibodies--application of platform approaches. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 848(1), 28–39. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2006.09.026

Wang, Y.J. and Hosken, B., 2014, Analytical Characterization of Proteins and Peptides. Biological Drug Products: Development and Strategies (Ch. 10), Pharmaceutical Sciences Encyclopedia, Pfizer, W.W. and Missouri, C (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey, 285-310 p.

Wurm, F.M., 2004, Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells, Nature Biotechnology, 22(11): 1393-1398 p.

Xing, Z., Kenty, B.M., Li, Z.J. and Lee, S.S., 2009, Scale‐up analysis for a CHO cell culture process in large‐scale bioreactors, Biotechnology and Bioengineering, 103(4): 733-746 p.

Yang, J.D., Lu, C., Stasny, B., Henley, J., Guinto, W., Gonzalez, C. and Gangi, J., 2007, Fed‐batch bioreactor process scale‐up from 3‐L to 2,500‐L scale for monoclonal antibody production from cell culture, Biotechnology and Bioengineering, 98(1): 141-154 p.

Yu, M., Hu, Z., Pacis, E., Vijayasankaran, N., Shen, A. and Li, F., 2011, Understanding the intracellular effect of enhanced nutrient feeding toward high titer antibody production process, Biotechnology and Bioengineering, 108(5): 1078-1088 p.

Zhang J., 2010, Mammalian Cell Culture for Biopharmaceutical Production (Ch. 12), Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, Baltz, R.H., Demain, A.L., Davies, J.E., Bull, A.T., Junker, B., Katz, L., Lynd, L.R., Masurekar, P., Reeves, C.D. and Zhao, H.. (Eds.), Third Edition, ASM Press, 157-178 p.